1567年，玛丽因贵族叛变而遭到囚禁，并被迫将苏格兰王位让给她的幼子詹姆斯。惊险逃脱后，她迅速逃往英格兰，却又被姑姑伊丽莎白囚禁。此后直至玛丽过世的二十年间，伊丽莎白与詹姆斯的敌对者仍然不停地筹划将玛丽推上英苏二国女王的宝座。

而利益方面的冲突也日益严峻，英国在西班牙大陆、美洲及大西洋的私掠行为(西班牙视其为海盗)严重影响西班牙的王室收入。

英国的跨大西洋奴隶贸易——由约翰·霍金斯爵士于1562年发起——获得伊丽莎白的支持，其无视西班牙政府控诉霍金斯在加勒比地区西属殖民地的贸易实已构成走私，更是让西班牙对英国视如仇寇。

1568年9月，一支由霍金斯与法兰西斯·德雷克爵士领导的奴隶买卖远征队遭到西班牙突击，造成数艘船舰于墨西哥韦拉克鲁斯沉船，即圣胡安战役。

这场交战使英西二国关系迅速恶化，翌年英国便扣押了数艘西班牙派遣至荷兰支援军队的珍宝舰队。德雷克与霍金斯则加强私掠以突破西班牙在大西洋贸易的垄断。

为达成宣扬新教的人生宗旨，伊丽莎白提供法国宗教战争与荷兰革命的新教势力援助、对抗西班牙。与此同时，腓力二世则大力压制新教的传播，资助法国战争的天主教联盟、支持爱尔兰的第二次德斯蒙德战争(1579年－1583年)，拥护爱尔兰天主教徒反抗伊丽莎白。

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