但是长州的异变始终是瞒不过幕府的耳目，对于长州的可疑举动，幕府做出了再次出兵对其进行讨伐的决定。

三月下旬，为迎接第二次长州征讨，新撰组需要扩充人手，便进行了第二次队士招聘。此时的招聘由土方岁三负责，并与斋藤一、伊东甲子太郎三人东下江户。此时的新撰组经过池田屋一役后声名大噪，不仅是京阪地区，就连在江户都是大名鼎鼎，众多浪士、武士都以加入这个号称“最强剑豪集团”的新撰组为荣。此次便成功获得队士五十四名，其中还包括近藤勇的表兄弟宫川信吉。

关于新屯所的问题，之前被要求借出境内用作新撰组屯所的西本愿寺方面，想尽了各种方法拒绝此事。先是将新撰组众位干部招待至京都有名的料亭享用美食，后又以寺内名义向新撰组“捐赠”贵重物品，笼络手段一个接着一个。但土方岁三是个性格倔强的人，逆反心理又重，他既心意已决，又岂会容许一点小小的贿赂就中断自己的计划。二月末，实在拗不过土方的西本愿寺门迹使田中主铃，向朝廷上表了公文，表示愿意借出境内作为新撰组新屯所使用。

幕府在经过了前一年的禁门之变、长州讨伐等事件中吸取了教训，将一直以来的军队训练体制由荷兰式改为法国式，佐幕的新撰组当然也响应幕府号召，按照法国式的标准来进行军事演练。

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