苏格兰女王玛丽·斯图亚特从一五五八年起，便认定自己是英国王位的合法继承人；事实上她最主要的目的，就是接下英国王位能带来的利益，因此她始终拒绝核准《爱丁堡条约》，这份条约完全断绝她在伊丽莎白女王之后，“英国王权第二顺位”的可能性。她也拒绝承认伊丽莎白为英国女王，甚至将英国军徽用在她的部队上。因为这些因素，一五六一年的夏天，伊丽莎白女王拒绝在玛丽·斯图亚特过境英国返回苏格兰时，给予安全通行权。女王后来随即改变心意，但到了八月十九日，玛丽·斯图亚特已经从法国搭船出发抵达爱丁堡的利思港。玛丽·斯图亚特回到暌违二十多年的王国，在许多方面都让伊丽莎白女王烦躁不已。除了因为她的表亲在欧洲天主教派的眼中是比伊丽莎白女王更适合的女王人选，而对伊丽莎白的王朝带来实质的威胁外，国境之北还有宗教冲突的阴影潜伏着：玛丽·斯图亚特告诉罗马教皇，她想要在苏格兰王国内重建天主教信仰。

对个人而言，伊丽莎白女王将玛丽·斯图亚特视为对手：她比伊丽莎白女王年轻，据说也较为貌美；而玛丽·斯图亚特的寡妇身份，代表英国女王不再是欧洲贵族追求的唯一对象。欧洲各国都认定玛丽·斯图亚特一定会再婚，因此她的择偶对表姑伊丽莎白女王来说，也是一大担忧，她担心欧洲的天主教强权进驻邻国。最重要的是，一个觊觎英国王位的天主教徒，距离如此近，让伊丽莎白女王感到芒刺在背。这些事情，加上两位女性执政者之间的角力，在接下来的四分之一个世纪内，一直都是英格兰与苏格兰之间关系的焦点。

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